ПЦР: метод, который слишком хорош

• Лабораторные методы обнаружения инфекций
• Этапы диагностики методом ПЦР
• Что может ПЦР
• Чего не может ПЦР
• Выводы

Созданный в 1983 году американским ученым Керри Муллисом, метод с использованием Полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году. Этот метод обнаружения ДНК стал одним из наиболее точных в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаружить то, что ранее оставалось незамеченным.

Почему же, несмотря на свою эффективность, этот прекрасный метод не вытеснил другие средства лабораторной диагностики, а применяется совместно с ними, уступая в определенных аспектах?

Методы лабораторного обнаружения инфекций

Существует множество способов выявления заражений в биологических жидкостях у пациентов.

• Методы микроскопии.

Лаборант с помощью микроскопа ищет патогенные микроорганизмы в специально окрашенном мазке — взятке из мочеиспускательного канала или слизистой оболочки. Этот метод дешев и прост, но не очень информативен. В результате можно увидеть трехомонады, гонококки, хламидии, уреаплазмы и гарднереллы. И все.

• Культурные методы (посевы).

На питательную среду в чашке Петри также наносят точно такой же мазок и ожидают роста. В результате образуются различные колонии микроорганизмов с разными характеристиками. По данным колониям можно установить, какие микроорганизмы присутствовали в мазке. Этот процесс, хотя и не слишком затратный, занимает много времени — от 3 до 8 недель, что может серьезно увеличить риск для пациента. Кроме того, важно помнить, что вырастет только то, что содержалось в мазке, в определенном количестве. Если патогенных микробов было слишком мало, их обнаружить может быть сложно.

• Анализы крови.

Каждый возбудитель оставляет свои иммунные следы в организме человека после контакта: антигены или антитела. Этот метод не является самым дешевым, но зато он очень быстрый. Однако стоит учитывать, что инфекция может уже быть в организме до момента выявления антител или антигенов: либо прошло недостаточно времени, либо концентрация патогенных микроорганизмов слишком низка. Кроме того, этот метод не способен различать различные виды микроорганизмов, которые не всегда представляют опасность для человека.

Таким образом, каждый из методов имеет свои недостатки. Среди наиболее значимых можно выделить следующие:

• Малая чувствительность означает, что в пробе должно быть определенное минимальное количество микроорганизмов для их обнаружения.
• Низкая специфичность означает, что если у двух разных видов бактерий (один опасный, другой нет) есть одинаковые белки на поверхности клетки, то не все тесты могут определить точный вид в организме.

Оба этих проблемы метод ПЦР помогает решать.

Этапы диагностики методом ПЦР

Основной идеей метода является то, что у каждого живого организма — микро- или макро- имеется своя уникальная ДНК (или РНК, если речь идет о некоторых вирусах). Это является идеальным показателем наличия чужеродного микроорганизма в организме человека. Даже при небольших следах ДНК в образце, это означает, что организм уже был в контакте с данной инфекцией. Но как можно обнаружить эти маленькие следы? Их необходимо сперва увеличить.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) включает в себя несколько этапов.

• 1 этап. Подготовка образца, то есть выделение ДНК.

Предположим, что мы пытаемся найти в образце определенную бактерию, например, хламидию (Chlamydia trachomatis — возбудитель хламидиоза). На данном этапе мы не уверены, наличествует ли в образце ее ДНК. Образец обрабатывается специальным образом, чтобы концентрировать ДНК, если она там присутствует, в минимальном объеме жидкости для проведения ПЦР.

• Этап номер два: ПЦР — умножение ДНК.

Сначала ДНК с двумя цепями развертывается путем нагревания, превращаясь в одноцепочечные нити. Затем в раствор добавляются специальные короткие фрагменты нуклеиновых кислот — праймеры, которые будут использоваться в качестве старта для синтеза второй цепи из ДНК. Итак, имеется база, имеется стартовый материал, теперь нужно лишь добавить нуклеотиды для построения второй цепи и фермент, который будет в этом процессе участвовать. Для этого процесса отвечает фермент — ДНК полимераза, а сам процесс превращения одноцепочечной ДНК в двухцепочечную называется полимеразной цепной реакцией.

Изначально были две однониточечных ДНК, но после процесса у нас появились две двуниточечных ДНК. Этот процесс повторяется многократно, пока не будет набрано достаточно образцов для дальнейшего анализа в лаборатории. Для увеличения количества ДНК применяют специальные устройства — амплификаторы. На этом этапе исследователи еще не знают, какая именно ДНК амплифицируется, и есть ли в образце ДНК какого-либо патогена, например, хламидии.

Также стоит отметить, что существует множество вариантов методов ПЦР, которые выбираются исследователем в зависимости от поставленных целей.

• Этап 3. Обнаружение ДНК.

Сегодняшний этап исследования направлен на выявление наличия ДНК необходимого бактериального вида в образце. Изначально для этого применялся метод электрофореза, но затем ученые перешли на использование ДНК-зондов – специальных меченых фрагментов ДНК, взаимодействующих только с определенным участком исследуемой ДНК и позволяющих определить конкретные последовательности нуклеотидов. Теперь для экспресс-диагностики используются флуоресцентные маркеры, которые позволяют определить результат ПЦР непосредственно в пробирке реакции. Если в образце присутствует ДНК хламидии, об этом узнает лаборант.

Что же делать, если геном вируса состоит не из ДНК, а из РНК? Например, это касается пандемического коронавируса SARS-CoV-2. В таком случае необходим дополнительный этап — обратная транскрипция. Сначала извлекают РНК из образца слизи, полученного из носоглотки, затем проводят процедуру обратной транскрипции, чтобы получить аналог в виде ДНК. После этого эту ДНК усиливают и определяют наличие вируса. Поэтому для выявления коронавируса применяют полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).

Что может ПЦР

Метод ПЦР применяется для выявления патогенных микроорганизмов и исследования их устойчивости к антимикробным препаратам. В сравнении с традиционными методами, ПЦР обладает высокой скоростью и точностью. В настоящее время метод ПЦР все чаще используется в клинической практике. Например, с его помощью можно определить наличие или отсутствие генетических маркеров устойчивости к лекарствам.

Преимущества метода ПЦР:

• Высокая чувствительность.

Для обнаружения даже одной копии ДНК патогенного микроорганизма в организме пациента достаточно использовать метод ПЦР. Это возможно благодаря высокой специфичности и чувствительности метода, что не достижимо для других видов диагностики.

• Высокая специфичность.

Как отмечалось ранее, уникальность ДНК каждого вида микроорганизмов позволяет идентифицировать их даже в случае наличия большого количества посторонней, лишней, затрудняющей анализ «балластной» ДНК.

• Скорость анализа.

Полный цикл диагностики методом ПЦР занимает не более одного рабочего дня.

• Эффективность.

ПЦР-диагностика на сегодняшний день является полностью автоматизированным процессом.

Чего нельзя достичь с помощью ПЦР

Метод ПЦР является поистине великолепным изобретением молекулярной биологии XX века. Но иногда он настолько хорош, что не подходит для диагностики.

Недостатки ПЦР:

• Специфичность.

Она необычайно высокая, но чрезмерно узкая. Посеешь ли в чашке Петри — и вырастет все, что было в образце. Но при проведении ПЦР возможно обнаружить лишь то, что искали, то, для чего использовали ДНК-зонды. Невозможно провести анализ на хламидии методом ПЦР и случайно обнаружить гепатит.

• Чувствительность.

Существует огромное количество микроорганизмов, которые врачи относят к услоно-патогенным. Они составляют часть нормальной микрофлоры человека, пока их количество не превышает определенных пределов. ПЦР, конечно же, выявляет их присутствие, однако это не означает, что человек болен. К таким микроорганизмам относятся микоплазма, уреаплазма, гарднерелла и другие.

• Проблема контаминации.

Загрязнение образцов ДНК внешними частицами является контаминацией. Для правильной диагностики методом ПЦР необходимо проводить анализ в специально оборудованных лабораториях, в абсолютно стерильных условиях. Наличие любой копии «чужой» ДНК из другого источника, попавшей из воздуха или с рук лаборанта, может привести к ошибочным результатам – в случае использования соответствующих праймеров.

• Воздействие других элементов образца на ПЦР.

Чувствительность ПЦР может быть значительно снижена под воздействием различных веществ. Например, некоторые медикаменты (антикоагулянты) могут подавлять реакцию амплификации. Для выявления подобных ситуаций существуют специальные методы контроля. Тем не менее, риск ложноотрицательных результатов все равно сохраняется.

• Затраты.

Этот способ требует значительных затрат. Приобретение оборудования и химреактивов для него, а также подготовка специалистов, умеющих с ними работать, стоят клиникам и лабораториям крайне дорого. В России подобное оборудование не выпускается, а использование российских реактивов ухудшает точность проведения анализов.

Выводы

• Метод ПЦР представляет собой эффективный и современный способ диагностики различных инфекционных заболеваний, но он не дешев.
• Не всегда необходимо делать анализ методом ПЦР. Если врач не назначает его, нужно довериться его опыту. Самостоятельное обследование в сетевых лабораториях с использованием ПЦР может привести к ошибочному лечению вымышленного заболевания.
• Если результат анализа вызывает сомнения, стоит пройти повторное обследование в другой лаборатории. Риски ошибок при диагностике не исчезают, несмотря на современность метода.

Основные преимущества ПЦР перед другими методами диагностики

Первое преимущество ПЦР заключается в его способности обнаруживать даже небольшие количества вирусов и бактерий в образцах тканей или жидкостей. Благодаря уникальной способности увеличивать количество ДНК или РНК микроорганизмов, ПЦР позволяет выявить инфекцию на самых ранних стадиях, когда другие методы диагностики могут оказаться неэффективными.

Другим важным преимуществом ПЦР является его специфичность. Метод позволяет проводить анализ с высокой точностью, исключая вероятность ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Это особенно важно в случаях, когда необходимо точно определить наличие определенной инфекции или генетического дефекта.

Метод ПЦР также обладает высокой скоростью выполнения анализа. В отличие от некоторых других методов, которые требуют много времени на подготовку образцов и проведение испытаний, ПЦР позволяет получить результаты быстро и эффективно, что особенно важно при диагностике срочных случаев.

Различные варианты применения ПЦР в медицине

Метод Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) нашел широкое применение в медицинской сфере благодаря своей высокой чувствительности и специфичности. Он используется для обнаружения и идентификации различных инфекций, генетических мутаций, а также в исследованиях по молекулярной диагностике и генетике.

Одним из важных вариантов использования ПЦР в медицине является диагностика инфекционных заболеваний. С его помощью возможно быстро и точно выявить наличие возбудителя инфекции, что существенно ускоряет начало лечения и позволяет предотвратить распространение болезни. Также ПЦР применяется для мониторинга эффективности лечения инфекций и контроля за процессом выздоровления пациента.

Другим важным направлением применения ПЦР в медицине является генетическая диагностика. С помощью этого метода можно выявить генетические мутации, связанные с наследственными заболеваниями, определить риск их возникновения у пациента или даже провести пренатальный скрининг для определения наличия генетических патологий у плода.

Кроме того, ПЦР используется в медицине для проведения исследований в области онкологии, идентификации патогенных микроорганизмов, а также в фармакогенетике. Этот метод стал незаменимым инструментом для многих клинических лабораторий, обеспечивая точность и надежность результатов и способствуя более эффективному лечению пациентов.

Ограничения и недостатки метода ПЦР

В данном разделе мы обсудим некоторые ограничения и недостатки метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые необходимо учитывать при использовании этого метода в диагностике и исследованиях.

Одним из основных ограничений ПЦР является вероятность возникновения ложноположительных результатов. Это может произойти из-за загрязнения образцов ДНК или РНК, ошибок в праймерах или амплифицируемых областях генома. В результате этого возможно неправильное определение наличия или отсутствия конкретного генетического материала.

Достоинства метода ПЦР	Недостатки метода ПЦР
Высокая чувствительность	Вероятность ложноположительных результатов
Скорость выполнения	Ограничение на размер обнаруживаемого фрагмента ДНК/РНК
Возможность детектировать низкие концентрации генетического материала	Зависимость от качества образца ДНК/РНК

Еще одним недостатком метода ПЦР является ограничение на размер обнаруживаемого фрагмента ДНК или РНК. Для того чтобы успешно провести реакцию ПЦР, необходимо заранее знать последовательность гена и подобрать праймеры, что может быть затруднительно в случае отсутствия информации о геноме организма.

Таким образом, несмотря на многочисленные преимущества метода ПЦР, следует помнить об ограничениях и недостатках при его применении в медицине и научных исследованиях.

Сравнение ПЦР с другими методами обнаружения инфекций

В данном разделе мы сравним метод ПЦР с другими способами обнаружения инфекций, выявим их основные отличия и преимущества.

• ПЦР vs Бактериологический анализ:

Одним из основных отличий метода ПЦР от бактериологического анализа является скорость получения результатов. В то время как бактериологический анализ может занять несколько дней, ПЦР способен дать результаты за несколько часов.

• ПЦР vs Иммунохимические методы:

Иммунохимические методы, такие как ELISA, используют антитела для обнаружения инфекции. В то время как ПЦР может обнаружить сам агент инфекции, что делает его более чувствительным и точным.

• ПЦР vs Серологические тесты:

В отличие от серологических тестов, которые прослеживают наличие антител в крови, ПЦР может непосредственно обнаружить генетический материал возбудителя инфекции, что делает его более надежным.

Видео по теме:

Вопрос-ответ:

Какое открытие в области молекулярной биологии принесло Нобелевскую премию по химии Кэрри Муллису в 1993 году?

Нобелевскую премию по химии в 1993 году за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР) ученому Кэрри Муллису.

Что такое Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и в чем заключается ее суть?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод в молекулярной биологии, позволяющий увеличить количество определенного участка ДНК в несколько миллионов раз путем циклического воспроизведения этого участка с использованием ферментов и нуклеотидов.

Какие преимущества имеет метод детекции ДНК на основе ПЦР по сравнению с другими методами?

Метод детекции ДНК на основе ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет обнаружить даже небольшие количества ДНК, а также быстро проводить анализы, что делает его одним из самых точных методов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Какое значение имеет ПЦР для современной медицины и диагностики инфекционных заболеваний?

ПЦР имеет огромное значение для современной медицины, так как позволяет быстро и точно выявлять наличие возбудителей инфекционных заболеваний, что помогает начать лечение вовремя и избежать осложнений.

Какие проблемы решает ПЦР, которые были неразрешимы до его появления?

ПЦР позволяет обнаружить те участки ДНК, которые оставались скрытыми и не могли быть обнаружены другими методами, что открывает новые возможности для молекулярной диагностики и исследований в области генетики и биологии.

Что такое Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и как она была открыта?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод умножения целевой ДНК в лабораторных условиях. Она была открыта американцем Кэрри Муллисом в 1983 году. Этот метод позволяет создавать множество копий ДНК, начиная с ее одиночного фрагмента.

Какие преимущества метода детекции ДНК на основе ПЦР?

Метод детекции ДНК на основе ПЦР имеет много преимуществ. Он позволяет обнаруживать инфекционные заболевания на ранних стадиях, когда они еще не проявляются симптомами. Кроме того, этот метод является одним из самых точных и надежных в лабораторной диагностике, что позволяет выявлять скрытые инфекции, которые ранее были недоступны для обнаружения.